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基于熒光成像的生命科學論文
1.激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡在傳統(tǒng)光學顯微鏡的基礎上作了改進，具有除目鏡與物鏡之外的圖片放大功能，可以隨時采集和記錄檢測信號，觀察活細胞的結構及特定分子、離子的生物學變化。其選擇單色性較好的激光作為光源，從根本上消除了色差。物鏡的焦平面上加了一個帶孔擋板，阻擋了焦平面外的雜散光，進一步消除色差。樣品被分解成二維或三維空間上的無數(shù)個點，激光束逐個掃描成像，進而組成整體的平面或立體圖像，計算機代替肉眼或照相機進行觀察或攝像，數(shù)字化的圖像在電腦中進一步處理，提高了圖像的清晰度。該儀器還使用了光電倍增管，將微弱的信號放大，大大提高了靈敏度。由于以上優(yōu)點，激光共聚焦顯微鏡可以應用到幾乎所有有關細胞研究的領域。如原位鑒定細胞或組織內(nèi)的生物大分子，觀察細胞或亞細胞的形態(tài)結構；無損傷實時檢測分析活細胞，并研究其形態(tài)和功能；在一個樣品上同時進行多重標記，實時觀察等。
2熒光探針
熒光探針在熒光成像技術中占據(jù)舉足輕重的地位。一般熒光探針需具備優(yōu)良的光物理性質(zhì)，以便于激發(fā)和檢測，且不與生物基質(zhì)同時被激發(fā)，還要有較高的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)。熒光探針的溶解度要大，便于溶于緩沖液或細胞培養(yǎng)液中，且熱、光性質(zhì)比較穩(wěn)定，有特異性標記位點。熒光探針需要具有良好的生物相容性，易于進入細胞內(nèi)。熒光探針大致分為兩類，包括化學類和生物類。化學類包括有機染料、納米材料（金納米粒子、半導體量子點等）及金屬配合物等。生物類包括藻膽蛋白、分子燈標及基因編碼熒光蛋白等。熒光探針在化學、光學、生物學等領域應用廣泛，但是，目前仍缺少有效的分子探針識別疾病分子水平上的獨特位點，故從分子水平上進行病理研究比較困難。
3熒光成像技術的應用
3.1蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測
生物體的生理狀態(tài)可以通過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來，生命活動離不開各種酶的作用，而酶大多是由蛋白質(zhì)構成的，故研究蛋白質(zhì)的結構和功能在認識生命活動過程中至關重要。劉亭延等采用熒光成像技術構建了一種檢測人血清蛋白質(zhì)的新方法。該方法以碳量子點為標記染料，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出人血清蛋白，優(yōu)化實驗條件，最終得到清晰的電泳圖。段相國等建立了一種ＨＣＶＮＳ３／４Ａ蛋白酶在小鼠體內(nèi)瞬間表達的模型。金屬離子在生物學中起重要作用，金屬離子與熒光探針結合，在熒光顯微鏡下可觀察細胞內(nèi)金屬離子的變化。Ｍｉｃｈａｅｌ等選用Ｉｎｄｏ－１為模板，合成了一系列檢測Ｃａ２＋的熒光探針，可用于確定活細胞中特定位置的Ｃａ２＋濃度。Ｓａｒｅ等合成了Ｚｎ２＋的熒光探針，并應用到細胞中Ｚｎ２＋的檢測識別中。人們還建立了Ｍｇ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｃｄ等離子的檢測模型。熒光成像技術應用于蛋白質(zhì)及細胞內(nèi)金屬離子檢測還存在一些問題，如有的熒光探針不能通過細胞膜、成像過程對細胞造成損害、檢測方法不統(tǒng)一等，因此，建立統(tǒng)一、低損害的熒光成像檢測技術仍是極具挑戰(zhàn)性的研究課題。
3.2腫瘤疾病的檢測和診斷
目前，腫瘤的臨床診斷主要依賴于顯微形態(tài)學觀察，從而在細胞層面上了解腫瘤細胞的類型與個體差異，這就要求檢測手段不斷進步。熒光成像技術以其操作方便、標記靶點多、靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應用于腫瘤跟蹤成像研究中，具有廣闊的臨床應用價值。高苒等建立了一種小鼠腫瘤模型，利用熒光顯微鏡和活體熒光成像儀可直接從整體和細胞水平上觀察腫瘤，了解宿主與腫瘤間的作用。至今為止，人們對此進行了深入的探討和研究，但該技術應用于體內(nèi)時需要考慮復雜的體內(nèi)環(huán)境，動物組織會產(chǎn)生背景噪音，影響該技術的發(fā)展應用。
3.3藥物新劑型研究
為了提高藥物療效，降低毒副作用，發(fā)展藥物新劑型尤為重要。熒光探針的不斷發(fā)展使熒光成像技術在這一領域的應用范圍不斷擴大，可用于對藥物運輸過程、細胞屏障跨越方式、藥物釋放過程等的觀測研究，它的迅速發(fā)展也大大促進了藥物新劑型研究的迅速發(fā)展。陳剛等研究了熒光探針經(jīng)內(nèi)耳給藥后的轉(zhuǎn)運通路，在熒光成像系統(tǒng)下追蹤了整個運輸過程。鐘華等構建了一種裝載抗癌藥物阿霉素的新型納米膠囊，采用激光共聚焦顯微鏡實時跟蹤觀察藥物投遞釋放過程，為新劑型的研究提供了理論平臺。目前，類似的研究雖然較多，但仍處于理論研究階段，諸如熒光探針毒性、生物體內(nèi)相容性等問題還沒有解決，沒有合理的規(guī)范，難以規(guī)模化生產(chǎn)。
4結論與展望
熒光成像技術的迅速發(fā)展加深了人們在分子水平對生命科學的了解，生命科學的研究也進一步推進了熒光成像技術的發(fā)展。激光共聚焦顯微鏡操作簡單，應用廣泛，熒光探針易于制備，熒光信號強，熒光成像技術可用于蛋白質(zhì)、金屬離子的檢測，在腫瘤等疾病的檢測中也起著重要作用，還可以實時跟蹤檢測給藥過程，為藥物新劑型的研究提供新的平臺。目前，熒光成像技術仍存在許多不足，主要為：細胞在可見光區(qū)有自發(fā)熒光，掩蓋了標記分子信號；難以實現(xiàn)對分子的長期標記檢測。熒光成像技術是基礎研究和實際應用間的重要紐帶，三者將相互促進，不斷進步。
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