靈芝孢子能夠調節(jié)妊高征大鼠所生幼鼠 海馬線粒體相關分子物質的

靈芝孢子能夠調節(jié)妊高征大鼠所生幼鼠 海馬線粒體相關分子物質的

作者：程進軍， 曾園山， 熊軼， 張偉， 陳穗君， 鐘志強
【摘要】 探討靈芝孢子對妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關分子物質的影響。方法:用一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）抑制劑N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）給予大鼠腹腔注射制備妊高征模型， 在此基礎上胃飼靈芝孢子。應用cAMP放免法、RT-PCR、酶活力檢測等技術評價靈芝孢子對妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關分子物質水平的影響。結果:妊高征孕鼠的剛分娩幼鼠海馬cAMP水平、線粒體DNA（mtDNA）水平及ATP合酶活力都降低。pgc1α表達水平與正常對照大鼠比較沒有變化。 生后30 d的幼鼠海馬cAMP水平、mtDNA水平、ATP合酶活力和pgc1α表達水平低于正常對照大鼠。胃飼靈芝孢子后，妊高征大鼠的剛分娩幼鼠和生后30 d的幼鼠海馬cAMP水平和mtDNA含量恢復到正常對照大鼠水平，ATP合酶活力和pgc1α表達水平也有恢復性增高。結論:靈芝孢子具有調節(jié)妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關分子物質水平的作用。
【關鍵詞】 大鼠
　　靈芝孢子（ Ganoderma spore， GS）是經過現代技術加工處理的靈芝生殖細胞，具有一定的防治疾病的功效。本研究組以往研究發(fā)現，靈芝孢子可以促進受損傷的神經元存活及其軸突再生［1， 2］，這提示靈芝孢子具有神經生物活性。一氧化氮（nitro-gen monoxide， NO）是調控神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)功能的重要信使分子。在妊娠高血壓征（妊高征）孕婦的血液中發(fā)現，NO和精氨酸的含量降低［3］。我們也發(fā)現，應用一氧化氮合酶（nitric oxide syn-thase， NOS）抑制劑N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）抑制NO生成，可以造成孕鼠的血壓升高及其胎鼠和所生幼鼠海馬的損傷，喂服靈芝孢子后可以部分緩解NO水平降低引起的損害［4， 5］。最新研究提示，NO可以促進線粒體生物發(fā)生（mitochondrial biogenesis）［6］。然而，妊高征孕鼠的NO水平降低是否引起其所生幼鼠海馬線粒體生物發(fā)生障礙，目前尚未見報道。本研究試圖探討靈芝孢子對妊高征大鼠所生幼鼠海馬線粒體相關分子物質水平的影響，為臨床服用靈芝孢子干預妊高征提供實驗資料。
　　1 材料與方法
　　1.1 實驗動物 SD成年雌性大鼠40只，體質量200～230 g，11～12周齡;SD成年雄性大鼠10只，體質量250～300 g，13～15周齡。由中山大學實驗動物中心提供，合格證號為（醫(yī)動字）第26-99C016號。按雌雄比例為2∶1合籠后的第2天觀察雌鼠陰道黏液（涂片法），有精子者被認為是妊娠0天（E0）。將這些妊娠鼠隨機分為:（1）正常對照組，于妊娠14～20 d（E14～E20）腹腔注射生理鹽水 胃飼蒸餾水;（2） L -NAME 蒸餾水組，注射 L -NAME 胃飼蒸餾水;（3） L -NAME 精氨酸組，注射 L -NAME 胃飼 L -精氨酸100 mg/（kg·d），分2次胃飼;（4） L -NAME 靈芝孢子組，注射 L -NAME 胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），分2次胃飼;（5）靈芝孢子 L -NAME 靈芝孢子組，注射 L -NAME前 1周 胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），注射 L -NAME后胃飼靈芝孢子8 g/（kg·d），均分2次胃飼。每組 5只。 除正常對照組每天分兩次注射生理鹽水和胃飼蒸餾水外，各組妊娠鼠于E14～E20腹腔注射 L -NAME 60 mg/（kg·d），分2次注射，2次之間相隔10 h。每次注射后2 h，再接著胃飼相應的蒸餾水、 L -精氨酸或靈芝孢子。
　　1.2 藥物 L -精氨酸購自美國Amresco公司， L -NAME 購自美國Sigma公司。靈芝孢子（2036）購自Holistal International Ltd，批號GANSP- SP04040104。 L -NAME用生理鹽水配制成溶液， L -精氨酸用蒸餾水配制成溶液，靈芝孢子用羧甲基纖維素鈉配制成溶液。
　　
　　1.3 取材 從上述處理的每只孕鼠剛分娩的0 d（P0）幼鼠中隨機選擇3只，取其海馬組織，分別用放射免疫、RT-PCR以及酶活力測定等方法進行相關檢測。剩余幼鼠飼養(yǎng)至生后30 d（P30）后用戊巴比妥鈉麻醉后放在冰盤上分離海馬組織，同樣用上述方法作各項相關檢測。
　　1.4 放射免疫法檢測cAMP水平 每只幼鼠海馬組織稱質量后，放入盛有2 ml冷凍醋酸緩沖液 （50 mmol/L， pH 4.75）的試管內，在冰上勻漿后加入 2 ml 無水乙醇，混勻，靜置5 min，3 500 r/min離心 15 min， 離心半徑為16.3 cm。60 ℃烘箱中烘干，4 ℃保存。測量時用1 ml醋酸緩沖液溶解后取 0.1 ml 檢測。檢測步驟及結果計算按照試劑盒要求操作。cAMP放免試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學核醫(yī)學實驗室。
　　1.5 RT-PCR檢測相關基因轉錄 P0和P30幼鼠中各收集3例分離海馬組織。將獲取的每只幼鼠海馬組織，按照Trizol試劑（北京賽百勝公司）說明一步法提取組織總RNA。取2 μl RNA經RT反應體系作用，在下列條件下合成cDNA:70 ℃ 5 min， 42 ℃ 60 min，94 ℃ 5 min。取RT產物1 μl對如下引物進行PCR。Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha （pgc1α）引物序列為:上游引物，5'cacagattcaagccagtgctac3';下游引物，5'cggagagttaaaggaagagcaa3'。tfam引物序列為:上游引物，5'gaaacgcctaaagaagaaagca3';下游引物， 5'aagtccatgggctacagaaaaa3'。 GAPDH引物序列為:上游引物，5'aacaagtaaccctcaaccctg3';下游引物，5'acac-cctctgatacccacatt3'。PCR反應程序:94 ℃預變性2.5 min。然后進入以下29個循環(huán):94 ℃變性45 s，54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min。循環(huán)完畢，72 ℃延伸5 min中止反應。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageTool軟件進行目的條帶光密度分析。
　　1.6 mtDNA水平測定 將獲取的每只幼鼠海馬組織，按照試劑盒（上海杰美基因公司）說明提取DNA，并按照如下引物應用PCR分別擴增COX3、COX4和GAPDH。COX3引物序列為:上游引物， 5'atgaccactaacaggagcccta3' ;下游引物，5'taggggattta-aaggggtgatt3'。COX4引物序列為:上游引物， 5'ggactcagaactcaagggaca

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