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前列腺癌中基質金屬蛋白酶7，9的表達及其與VEGF的關系
作者：周洪瀾 邢春偉 葛巖 王心蕊 王醫術【摘要】 目的 探討基質金屬蛋白酶7，9在前列腺癌轉移侵襲中的作用，以及VEGF與基質金屬蛋白酶的關系。方法 采用免疫組織化學和形態定量分析方法分析MMP7及MMP9表達情況，同時培養PC3M細胞并采用Boyden小室侵襲試驗及酶譜分析觀察MMP9及其與VEGF在前列腺癌中的作用。結果 前列腺癌各分級中MMP7和MMP9的表達均有顯著性差異(P＜0?001)。Boyden小室侵襲實驗顯示，不同試驗組穿透Matrigel的細胞數依次遞減，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M MMP9Ab (1∶50)，均有顯坐的統計學差異(P＜0?01)。酶譜分析觀察發現，直接培養于培養皿表面的PC3M 細胞僅有穩定的MMP?9和MMP?2酶原表達，但PC3M細胞與VEGF共孵育組條件培養基中MMP?9酶原含量以VEGF劑量依賴的方式增加。結論 MMP7和MMP9可作為腫瘤侵襲和轉移的判定指標。VEGF與MMPs的分泌有關，其機制有待于進一步探討。
【關鍵詞】 前列腺癌；基質金屬蛋白酶；血管內皮細胞生長因子
基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）生物學效應貫穿于腫瘤發展的各個環節〔1，2〕。血管內皮生長因子(VEGF)作為一種與腫瘤發生、發展密切相關的生長因子，可通過細胞內信號轉導的級聯放大效應而調節MMPs的產生與活化〔3，4〕，使得細胞外基質（ECM）處于不斷地合成與分解代謝的動態平衡中，這種動態平衡的穩定是維持組織細胞結構和功能的重要基礎。本研究以前列腺癌作為研究對象，探討前列腺癌中金屬蛋白酶與腫瘤轉移侵襲的關系，以及金屬蛋白酶和VEGF的關系。
1 材料與方法
1?1 材料
所有前列腺癌材料取自手術切除的新鮮組織，共計34例，其中5例Gleason Grade 2，9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4，6例Gleason Grade5。5例正常前列腺組織取自意外死亡的正常男性青年。所有標本均經嚴格篩選并經病理診斷證實。體外培養前列腺癌細胞PC3M由吉林大學基礎醫學院病理生理學教研室惠贈；NIH3T3細胞由吉林大學第三臨床學院中心實驗室惠贈。
1?2 免疫組織化學染色
免疫組織化學染色采用鏈霉素抗生物素蛋白?過氧化物酶連接法（SP法）。所用一抗(MMP7，9，13)、二抗、三抗及DAB均購自邁新公司。步驟如下：梯度脫水、脫蠟，過氧化物酶(A液)阻斷15 min，非免疫動物血清(B液)封閉；加入一抗，4℃過夜后；加生物素標記二抗(C液)30 min，滴加鏈親和素?過氧化物酶溶液(D液)30 min；DAB發色，水洗終止；蘇木精復染細胞核，常規脫水透明，中性樹膠封片。
1?3 形態定量方法
通過Cooled CCD采集預計數視野圖片，而后采用Image?Pro Plus Analysis Software分析表達陽性的切片。
1?4 細胞培養
在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培養液中培養人前列腺癌細胞PC3M。
1?5 Boyden小室腫瘤侵襲試驗
NIH3T3條件培養液的制備：鋪Matrigel基膜膠，收集前列腺癌細胞，向小室上室內加入100 μl癌細胞懸液，于37℃，5%CO2條件下孵育4～6 h，醋酸?酒精?甲醛固定液固定20 min，HE染色，中性樹膠封片。侵襲細胞的計數：在400×視野下任取10個不重復視野，利用目鏡測微尺計數每個視野穿透Matrigel基膜膠下室面的腫瘤細胞數目，計算平均值。
1?6 酶譜分析
酶譜分析基本步驟：配制含1 mg/ml明膠的10%SDS?PAGE底物；將已制好的濃縮蛋白樣品不經加熱直接上樣；以5 mA/gel電泳，當樣品進入分離膠后，將電泳電流提高到10 mA/gel；電泳完成后，將底物膠置于孵育緩沖液中37℃緩慢搖擺18 h，以使待測MMPs充分作用于底物；孵育結束后經考馬斯亮藍染色30 min及脫色液（45%甲醇，10%冰乙酸）脫色60 min，觀察結果。利用圖像分析軟件對酶譜分析結果進行灰度掃描。利用紫外分光光度法測蛋白質含量，每組細胞設3個平行樣本，組織酶譜分析重復多次觀察。具體步驟：電泳、封膠后，利用圖像分析程序，讀取圖像反轉膜式后各消化條帶的灰色度及面積，計算各條帶的酶含量。酶含量=條帶面積×（條帶灰度減于背景灰度），將所得值再換算成單位蛋白表達量作為最終測得的酶含量值，從而對各組細胞的酶活性進行定量比較。
1?7 統計學處理
所有統計均由INSTAT統計軟件包完成。兩組間均數采用t檢驗。
2 結果
2?1前列腺癌中MMP7和MMP9的表達
5例正常前列腺組織中，MMP7和MMP9均為3例陽性表達和2例陰性表達。前列腺癌中MMP7和MMP9均陽性表達，其蛋白均主要表達于腫瘤細胞胞漿或胞膜中，部分間質細胞和血管內皮細胞也呈陽性表達（圖1），MMP7灰度值為32 047 930±9 499 987，MMP9灰度值為23 873 011±14 414 601。前列腺癌各分級中MMP7和MMP9的表達均有顯著性差異(P＜0?001)（圖1）。
2?2 Boyden小室侵襲實驗
在Boyden小室的上室內分別加入前列腺癌細胞PC3M，PC3M MMP9Ab (1∶100)，PC3M MMP9Ab (1∶50)，結果顯示，穿透Matrigel的細胞數依次遞減，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M M
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