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研究海帶多糖體外抗氧化作用
摘要： 目的 研究海帶多糖體外抗氧化作用。方法 采用體外實驗研究海帶多糖對羥自由基、超氧陰離子的清除作用以及對 H2O2 誘導的紅細胞氧化溶血和大鼠肝勻漿脂質過氧化的保護作用。結果 海帶多糖體外可清除O-2· 及 ·OH; 抑制 H2O2 誘導的大鼠紅細胞氧化性溶血; 抑制小鼠組織MDA的生成。結論 海帶多糖體外具有清除自由基及抗脂質過氧化的作用。
關鍵詞： 海帶多糖;氧自由基;脂質過氧化;抗氧化
海帶屬海帶目海帶科，含有多種生物活性成分，其大部分生物活性與其中的多糖成分密切相關[1]。海帶多糖(laminarin)是從海帶中提取出來的多糖類化合物。梁桂林[2]等對海帶多糖進行體內抗氧化研究，結果表明海帶多糖在體內具有抗氧化活性。本文對海帶多糖的體外抗氧化作用進行了探討。
1 材料與方法
1.1 材料
海帶多糖的提取、純化及紙層析鑒定法按文獻[3]制備。將市售干海帶適度粉碎,用蒸餾水浸泡,加熱提取,冷卻離心,濃縮,濃縮液加入4 倍體積的 95% 乙醇沉淀,沉淀物依次用無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌,用蒸餾水復溶,透析,Seveg 法除蛋白,常規干燥得海帶多糖。紙層析分析表明,海帶多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖等組成。硫酸-苯酚法測多糖含量為 85%，考馬司亮藍法測定總蛋白含量。
硫代巴比妥酸購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：20080925);肝素為萬邦醫藥(批號：0812111);抗壞血酸為福州海王福藥制藥有限公司產品(批號：0901042);硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸等均為市售分析純試劑。
752N紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);TDL?60B臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠);BS124S分析天平 (北京賽多利斯儀器系統有限公司) ;HH?S數顯恒溫水浴鍋(常州市國立試驗設備研究所) ;XH?C旋渦混合器(常州市國立試驗設備研究所)。
實驗動物為昆明種清潔級小鼠10只，體質量18～22 g，雌雄各半，由福州海王福藥制藥有限公司提供，許可證號：SCXK(閩)2005?0003。
1.2 方法
1.2.1 海帶多糖清除·OH 效果的測定 根據Smirnoff 等的方法改進[4]，用FeSO4 H2O2 產生·OH，以·OH 氧化水楊酸所得產物的吸光值表示·OH 的多少，吸光值越大，·OH 越多。 4 mL 反應體系中含9 mmol/ L FeSO4 1 mL ，8.8 mmol/ L H2O2 1 mL ，9 mmol/ L水楊酸1 mL(用50%乙醇作溶劑)及1 mL 不同濃度的海帶多糖，最后加H2O2 啟動反應，37 ℃溫浴1 h，于 510 nm 測吸光值。空白組以重蒸水代替水楊酸和海帶多糖，對照組以重蒸水代替海帶多糖。清除率以[A0-(Ai-Ai0)]/ A0 × 100% 計算，其中 A0 為對照，Ai 為海帶多糖某濃度時的吸光值，Ai0為空白組的吸光值。
1.2.2 海帶多糖清除O-2 效果的測定[5] 每支試管加Tris?HCl緩沖液 (pH 8.2) 4.5 mL ，25 ℃ 預熱 20 min ，加1 mL 不同濃度的海帶多糖，再加10 mmol/ L 的鄰苯三酚 0.4 mL ，立即搖勻，準確反應4 min ，立即加入8 mol/ L HCl 0.1 mL終止反應，325 nm 測吸光值。空白組以重蒸水代替鄰苯三酚和海帶多糖，對照組以重蒸水代替海帶多糖。清除率以(A0-Ai)/(A0-Ai0)× 100%計算，其中A0為對照，Ai為海帶多糖某濃度時的吸光值，Ai0為空白組的吸光值。
1.2.3 海帶多糖對小鼠紅細胞H2O2 所致溶血的影響[6] 小鼠頸總動脈采血，肝素抗凝，4 ℃ 3 000×g離心得紅細胞，冷生理鹽水洗 3 次，制成0.5% 懸浮液。取紅細胞懸液 1 mL ,加不同濃度的海帶多糖，最后加50 mmol/ L H2O2 0.5 mL混勻，37 ℃ 溫浴1 h，加生理鹽水 4 mL，3 000 r/min 離心5 min，取上清于415 nm測定其吸光值。正常組以生理鹽水代替H2O2和海帶多糖，模型組以生理鹽水代替海帶多糖。以模型組為100 %溶血，計算溶血度及抑制率。
1.2.4 海帶多糖對生成 MDA 抑制作用的測定 小鼠頸椎脫臼致死，迅速分離出肝組織和心組織，用冷的生理鹽水洗凈后稱重，冰浴下勻漿，制成含蛋白質0.5%的懸浮液。
取5% 肝/心勻漿懸浮液0.2 mL，加入不同濃度海帶多糖溶液1 mL，在37 ℃溫浴1 h 后，加入20% TCA 1 mL 終止反應,再加0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，測532 nm上清液吸光度，以吸光度表示MDA 含量的多少。對照組以重蒸水代替海帶多糖，清除率以(A0-Ai)/A0 × 100% 計算，其中為A0為對照，Ai為海帶多糖某濃度時的吸光值。
1.2.5 海帶多糖對Fe2 ?H2O2 誘導的小鼠肝線粒體中MDA生成的影響 肝組織于在冰浴下以生理鹽水制成10 %勻漿，2 000 r/ min 離心20 min，取上清液，以10 000 ×g 離心 20 min,沉淀用生理鹽水洗滌 2 次后,以生理鹽水配成吸光值在 0.5～0.6 的線粒體懸浮液[7]。取肝線粒體懸浮液 2.5 mL，加入不同濃度海帶多糖 溶液0.4 mL，再加入1 mmol/ L FeSO4 0.1 mL，1 mmol/ L H2O2 0.1 mL，在37 ℃溫浴1 h 后，取0. 1 mL 溫育后的各管溶液，加入20 % TCA 1 mL 終止反應，再加0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，于532 nm 測上清液吸光值。對照組以重蒸水代替海帶多糖，清除率如“1.2.4”計算。
1.3 統計學處理
實驗結果以(±s)表示，進行組間t檢驗，以P
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