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羅布麻葉頂空氣相色譜—質(zhì)譜指紋圖譜的研究
【摘要】
【目的】建立羅布麻葉揮發(fā)性成分頂空氣相色譜—質(zhì)譜（HSGC?MS）指紋圖譜分析方法,評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地羅布麻葉藥材的質(zhì)量。【方法】采用HSGC?MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地羅布麻葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,測(cè)定其指紋圖譜,確定共有指紋峰,并作模糊聚類分析和相似度評(píng)價(jià)。【結(jié)果】羅布麻葉揮發(fā)性成分中含有14個(gè)特征性指標(biāo)成分,初步建立了以此14個(gè)共有峰為特征指紋信息的HSGC?MS指紋圖譜。【結(jié)論】本方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,可作為羅布麻葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 羅布麻葉/化學(xué)；揮發(fā)性成分/分析；指紋圖譜
羅布麻葉為《中國(guó)藥典》收載的常用中藥,系夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetom L.的干燥葉,具有平肝安神、清熱利水之功效［1］。現(xiàn)代用于治療高血壓、高血脂、冠心病、哮喘、氣管炎等疾病有較好的效果［2］。羅布麻葉揮發(fā)性成分為主要活性成分之一,如芳樟醇有鎮(zhèn)靜、降血壓、抗菌等作用［3］,薄荷酮和胡薄荷酮有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用［4］,藏紅花醛有較強(qiáng)的抗癌活性［5］,氧化石竹烯有平喘、鎮(zhèn)靜、抗癌作用,1?α?萜品醇有顯著平喘功效［6］,但尚未見(jiàn)有關(guān)羅布麻葉揮發(fā)油指紋圖譜研究的報(bào)道。本研究采用頂空氣相色譜—質(zhì)譜（HSGC?MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地羅布麻葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。
1儀器與試藥
Agilent 6890/5975B型氣—質(zhì)聯(lián)用分析儀,G1701DAD.03.00.611工作站,Agilent G1888頂空自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)安捷倫儀器公司),NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)。
羅布麻葉各產(chǎn)地樣品為實(shí)地采集或由當(dāng)?shù)厮幉墓咎峁?編號(hào)為：S1?江西,S2?安徽,S3?吉林,S4?山東,S5?山西,S6?江蘇,S7?新疆,S8?河北,S9?內(nèi)蒙古,S10?天津,S11?遼寧,S12?陜西。均經(jīng)研究者鑒定為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetom L.的葉。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。
2方法與結(jié)果
2.1分析條件
2.1.1色譜條件色譜柱：HP?5MS(涂布濃度為5%的苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱,30.0 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：180℃；程序升溫：50℃保持20 min,以4℃/min的速率升至200℃,保持5 min；載氣：He氣,流量：1.0 mL/min,分流比15∶1。
2.1.2質(zhì)譜條件電離方式：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：230℃,四級(jí)桿溫度：150℃,接口溫度：280℃；電子倍增器電壓：1 329.4 V；電子能量:70 eV；掃描范圍：45.0~650.0 aum。
2.2頂空供試品制備
通過(guò)對(duì)藥材粉碎粒度、體積裝樣量、頂空加熱溫度及頂空加熱時(shí)間進(jìn)行考察,確定羅布麻葉揮發(fā)性成分優(yōu)化的頂空條件：取羅布麻葉粉末(過(guò)40目篩)3 g,精密稱定,置頂空瓶中,密封,放入頂空進(jìn)樣器,120℃加熱平衡30 min,供測(cè)試。
2.3方法學(xué)考察
2.3.12 h記錄圖取羅布麻葉揮發(fā)性成分進(jìn)樣分析,結(jié)果表明：60～120 min無(wú)出峰,提示50 min內(nèi)揮發(fā)性成分出峰完全。
2.3.2精密度試驗(yàn)取羅布麻葉(S2)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果表明：14個(gè)指標(biāo)成分群保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.21%,相對(duì)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,提示儀器精密度良好。
2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取羅布麻葉(S2)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,分別在1、3、6、24、48、120 h進(jìn)樣6次,得14個(gè)主要特征峰保留時(shí)間、相對(duì)含量。結(jié)果表明：14個(gè)指標(biāo)成分群保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.29%,相對(duì)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,提示120 h內(nèi)樣品(溶液)穩(wěn)定性較好。
2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次羅布麻葉(S2)5份,提取揮發(fā)性成分后分別進(jìn)樣分析,得14個(gè)主要特征峰的保留時(shí)間和相對(duì)含量。結(jié)果表明：14個(gè)指標(biāo)成分群保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0%～1.37%,相對(duì)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83%～5.15%,說(shuō)明重復(fù)性較好。
2.4指紋圖譜建立
樣品按選定的頂空條件及分析條件進(jìn)行分析,測(cè)得所有供試品的氣相色譜—質(zhì)譜（GC?MS）總離子流圖；再對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖,所有組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理和NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索鑒定,并與有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)譜圖核對(duì),初步確定出羅布麻葉揮發(fā)性成分中53種化合物。根據(jù)羅布麻葉揮發(fā)性成分HSGC?MS總離子流圖所給出的峰數(shù)高、峰保留時(shí)間和峰面積值等相關(guān)參數(shù)以及成分鑒定結(jié)果,進(jìn)行分析、比較,制定HSGC?MS指紋圖譜(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)第666頁(yè))。
2.5指紋圖譜分析
2.5.1共有指紋峰的標(biāo)定經(jīng)對(duì)揮發(fā)性成分GC?MS總離子流圖的分析、比較,羅布麻葉標(biāo)定14個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰,1～14號(hào)峰化學(xué)成分依次為：2?戊烯?1?醇、未鑒定、1,2,5,5?四甲基1,3?環(huán)戊二烯、3,5?二甲基苯酚、安息香醛、2?戊基呋喃、順式氧化芳樟醇、2,6?二甲基環(huán)己醇、薄荷酮、藏紅花醛、β?環(huán)檸檬醛、胡薄荷酮、大馬酮、5,6,7,7A?四氫?4,4,7a?三甲基(4H)?苯呋喃酮。以2?戊基呋喃(6號(hào)峰)為參照峰,分別求出各共有峰與之相比的α值(調(diào)整保留時(shí)間之比)和各共有峰的相對(duì)峰面積(峰面積之比)，見(jiàn)表1。表1羅布麻葉揮發(fā)性成分中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間α值和相對(duì)峰面積（略）
2.5.2指紋圖譜的聚類分析選擇羅布麻葉揮發(fā)性成分中14個(gè)比較明顯的共有峰,根據(jù)表1中的數(shù)據(jù),采用SPSS 15.0軟件中的hierarchical cluster analysis對(duì)12個(gè)羅布麻葉樣品進(jìn)行聚類分析,所用聚類方法為average linkage (between groups),距離公式為square euclidean distance,得不同樣品羅布麻葉的聚類分析圖。
圖2結(jié)果顯示：當(dāng)距離標(biāo)尺在1時(shí),樣品5、6、11,樣品1、3、10,樣品2、9各歸為一類；當(dāng)距離標(biāo)尺在2時(shí),樣品5、6、11與樣品4、8歸為一類；當(dāng)距離標(biāo)尺在3時(shí),樣品4、5、6、8、11與樣品1、3、10歸為一類,樣品2、9與樣品7歸為另一類；當(dāng)距離標(biāo)尺在8時(shí),樣品1、3、4、5、6、8、10、11與樣品2、7、9歸為一類；當(dāng)距離標(biāo)尺在25時(shí),樣品12才與樣品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11即全部聚為一類。
2.5.3色譜峰的重疊率以羅布麻葉9號(hào)樣品圖譜為基準(zhǔn),按以下公式計(jì)算重疊率=［待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品共有的峰數(shù)×2/(待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品峰數(shù)和)］×100%。分別求得另外11種樣品色譜峰的重疊率依次為：64.0%、82.5%、72.7%、79.5%、78.9%、75.7%、76.3%、67.6%、64.7%、74.6%、92%。
2.5.4相似度評(píng)價(jià)將測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel表格,采用中位數(shù)夾角余弦法計(jì)算相似度,進(jìn)行色譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)。各相似度值如下：S1?0.959、S2?0.925、S3?0.977、S4?0.986、S5?0.991、S6?0.957、S7?0.979、S8?0.963、S9?0.973、S10?0.987、S11?0.932、S12?0.888。結(jié)果顯示，羅布麻葉樣品指紋圖譜相似度較好,均在0.88以上。
3討論
揮發(fā)性成分頂空條件的優(yōu)化：藥材粉碎粒度的考察結(jié)果表明,60目藥材粉末所得色譜峰峰數(shù)比40目、30目藥材峰數(shù)明顯減少,40目所得色譜峰數(shù)峰高較30目高,故粉碎粒度選擇40目藥材粉末。體積裝樣量的考察測(cè)定結(jié)果表明,1.5 g藥材所測(cè)出的色譜峰數(shù)較少,2 g藥材峰面積較小,3 g藥材測(cè)出的色譜峰較多,峰面積較大,故體積裝樣量選擇3 g。
頂空加熱溫度的考察測(cè)定結(jié)果表明,90℃和100℃加熱溫度下檢出色譜峰的峰數(shù)明顯減少,110℃和120℃加熱檢出的色譜峰中后者峰高較高,故樣品加熱溫度選擇120℃。頂空加熱時(shí)間的考察測(cè)定結(jié)果表明,4個(gè)不同加熱時(shí)間下的峰數(shù)相差不多,加熱30 min的峰高較高,故樣品加熱平衡時(shí)間選擇30 min。
不同產(chǎn)地羅布麻葉中均含有2?戊烯?1?醇、未鑒定、1,2,5,5?四甲基1,3?環(huán)戊二烯、3,5?二甲基苯酚、安息香醛、2?戊基呋喃、順式氧化芳樟醇、2,6?二甲基環(huán)己醇、薄荷酮、藏紅花醛、β?環(huán)檸檬醛、胡薄荷酮、大馬酮、5,6,7,7A?四氫?4,4,7a?三甲基(4H)?苯呋喃酮等14種主要成分,占揮發(fā)性總成分的60%左右,故以此14個(gè)特征性指標(biāo)成分作為共有特征峰構(gòu)建GC?MS指紋圖譜。
應(yīng)用模糊聚類法分析比較,能揭示揮發(fā)性成分中特征性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的配比關(guān)系,更能全面、綜合、準(zhǔn)確地反映不同產(chǎn)地藥材GC?MS指紋圖譜的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)初步建立了羅布麻葉揮發(fā)性成分GC?MS指紋圖譜分析方法,而且方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，為羅布麻藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和GAP實(shí)施提供了科學(xué)依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
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