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三種方法檢測耐甲氧西林葡萄球菌方法的評價
【關鍵詞】 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴散法；微量稀釋法
［摘要］ 目的：評價3種檢測耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)方法的臨床應用價值。方法：用頭孢西丁紙片擴散法，苯唑西林微量稀釋法和PCR檢測mecA基因?qū)εR床分離98株葡萄球菌進行檢測并作比較。結(jié)果：98株中有63株耐甲氧西林葡萄球菌，3種檢測方法差異無顯著性。結(jié)論：頭孢西丁紙片擴散法可作為基層醫(yī)院微生物實驗室日常工作檢測甲氧西林的簡便又準確的實驗方法。
［關鍵詞 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴散法；微量稀釋法
葡萄球菌是人類感染的最重要的病原菌之一［1］，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)所造成的院內(nèi)感染一直是臨床普遍關注的問題，而凝固酶陰性的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant oaagulase megative staphylooocci，MRCNS)近年來報道增多，其耐藥性比凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌更高，造成臨床治療上的困難。由耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant staphylooocci，MRS)引起的感染已經(jīng)成為臨床抗感染治療的難題之一。怎樣快速、準確地檢測出MRS及預測其耐藥性變化對臨床治療及合理應用抗生素都有十分重要的意義。為此，我們對MRS的檢測方法進行了探討，現(xiàn)報告如下。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1.1 菌株來源 收集了2005年9月至12月本院臨床科室各類標本中分離的葡萄球菌共98株，并經(jīng)血漿凝固酶試驗和法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK32全自動微生物分析儀系統(tǒng)，配套的GPI和GNI細菌鑒定板鑒定，嚴格按照細菌鑒定程序進行。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923。
1．1.2 主要試劑 GPI細菌鑒定板和GPS藥敏板條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。頭孢西丁(30 μg)紙片為英國OXOID公司商品，藥敏試驗所用培養(yǎng)基MuelleHinton(MH)瓊脂購自杭州微生物試劑廠。mecA基因檢測引物由上海生物工程公司合成。
2 方法
2．1 最低抑菌濃度(MIC)測定 用GPS-109藥敏鑒定卡在Vitek32全自動微生物分析/藥敏系統(tǒng)測定苯唑西林MIC，遵循美國臨床和實驗室標準化研究所CLSI制定的判斷標準。
2.2 頭孢西丁紙片擴散試驗 按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進行，菌液濃度0.5麥氏濁度(1.5×108 CFU／ml)。結(jié)果判斷標準：金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥，≥20 mm為敏感，凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑≤24 mm為耐藥，≥25 mm為敏感。
2．3 PCR檢測mecA基因 挑取菌落置入內(nèi)含有100 μl生理鹽水的0.5 mL離心管內(nèi)，離心(15 000 r／min)5 min吸棄上清液加裂解液A(0.5%非離子去污劑)50 μl和裂解液B(200 ug／ml蛋白酶K)5 μl置55 ℃保溫1 h后置入95 ℃保溫5 min。離心(10 000 r／min)30 s，上清液即為模板。PCR引物序列P1(5’-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3’)，P2(5’-AATGGGACCAACATAACCTA-3’)，PCR反應體系50 μl，熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性5 min,94 ℃1 min，48 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min，PCR擴增產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，以224 bp處出現(xiàn)熒光條帶為mecA基因陽性。金葡菌ATCC 25923作為陰性對照，陽性對照模板DNA由上海生物工程公司提供。
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