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慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰IL8、TNFα水平和炎癥細(xì)胞的分布
【摘要】 目的 比較穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年患者、老年健康吸煙者和老年健康非吸煙者痰液中IL8、TNFα水平和炎癥細(xì)胞組成的差異，進(jìn)而探討IL8、TNFα、中性粒細(xì)胞與吸煙的相關(guān)性以及COPD氣道炎癥的性質(zhì)。 方法 98例老年研究對(duì)象分為3組：COPD組38例、健康吸煙組（HS）30例、健康不吸煙組（HNS）30例，誘導(dǎo)痰方法收集痰液，細(xì)胞分類(lèi)及計(jì)數(shù)，并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定痰上清液中IL8、TNFα濃度。結(jié)果 COPD組痰液中IL8,、TNFα、中性粒細(xì)胞百分比明顯高于健康吸煙組及健康不吸煙組；COPD組痰液中IL8、TNFα水平與中性粒細(xì)胞百分比呈顯著正相關(guān)性（r=0761,r=0495）；健康吸煙組痰中IL?8水平與中性粒細(xì)胞百分比亦呈顯著正相關(guān)性（r=0544）。結(jié)論 IL8和TNFα和中性粒細(xì)胞共同參與了吸煙者COPD氣道炎癥反應(yīng)。【關(guān)鍵詞】 慢性阻塞性肺疾病；氣道炎癥；IL?8；TNF?α；中性粒細(xì)胞
約80%～90%的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者是吸煙者，但是僅有20%的吸煙者發(fā)展為COPD〔1〕，提示對(duì)COPD易感性不同的人群，其氣道對(duì)同樣的香煙刺激的反應(yīng)性不同。目前認(rèn)為，吸煙引起的氣道和肺組織異常的炎癥反應(yīng)是COPD發(fā)病學(xué)的中心環(huán)節(jié)，多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與COPD復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)。以往的研究認(rèn)為在COPD急性加重期氣道中性粒細(xì)胞明顯增加〔2〕，而在穩(wěn)定期COPD患者和吸煙肺功能正常者之間氣道中性粒細(xì)胞是否存在差異爭(zhēng)議頗大〔3～5〕。IL?8和TNF?α有較強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化作用，本文比較了穩(wěn)定期COPD老年患者、老年健康吸煙者和老年健康非吸煙者痰液中IL?8、TNF?α水平炎癥細(xì)胞的差異，進(jìn)而探討COPD氣道炎癥的性質(zhì)。
1 材料與方法
1?1 研究對(duì)象
本研究對(duì)象均為男性，來(lái)自2004～2005年門(mén)診病例及健康查體人員，經(jīng)詢(xún)問(wèn)病史、體檢、X線檢查、肺通氣功能檢查，分為以下3組：
1?1?1 COPD組
符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕并處于穩(wěn)定期的患者38例，年齡60～78歲，平均（63?6±6?2）歲，均有吸煙史，其中戒煙者4例，戒煙年限15～23年，吸煙年限18～46年，根據(jù)肺功能測(cè)定結(jié)果，對(duì)COPD的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)〔6〕。本組病人支氣管舒張?jiān)囼?yàn)均為陰性，排除呼吸道變態(tài)反應(yīng)病史及肺癌、心功能不全等疾患。
1?1?2 健康吸煙組（HS）
30例，年齡61～73歲，平均（64?1±5?9）歲。肺功能檢測(cè)FEV1?0占預(yù)計(jì)值(pred)百分比均＞80% ，F(xiàn)EV1?0/FVC均＞70%，支氣管舒張?jiān)囼?yàn)均為陰性。排除呼吸道變態(tài)反應(yīng)病史及肺癌、心功能不全等疾患。
1?1?3 健康不吸煙組(HNS)：30例，年齡60～74歲，平均（63?5±7?1）歲。肺功能檢測(cè)FEV1?0占預(yù)計(jì)值百分比均＞85%，F(xiàn)EV1?0/FVC均＞70%。
1?2 實(shí)驗(yàn)步驟及方法
1?2?1 肺功能檢查
所有研究對(duì)象在入選前進(jìn)行肺功能測(cè)定，記錄用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1)、第1秒用力呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1/pred%)、第一秒用力呼氣量占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)。
1?2?2 痰標(biāo)本的收集及處理
參照文獻(xiàn)〔7，8〕報(bào)道的方法，首先吸入喘康速200 μg，超聲霧化吸入3%高滲鹽水（霧化量為0?4 ml/min），霧化時(shí)間為5～10 min。將病人咳出的痰收集于無(wú)菌干燥的培養(yǎng)皿中，挑選出黏液部分放入無(wú)菌干燥試管中稱(chēng)重，加入4倍量0?1%DTT（二硫蘇糖醇），37℃水浴15 min，以有效溶解痰液，再加入4倍量磷酸鹽緩沖液（0?01 mol/L pH7?4 PBS）充分洗滌細(xì)胞5 min，2 000 r/min離心10 min。離心后的上清液-70℃保存待測(cè)，沉淀留作痰細(xì)胞學(xué)檢查。
1?2?3 痰液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)
制備痰細(xì)胞學(xué)涂片2～3張，室溫下自然風(fēng)干，做HE染色。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)，至少計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，分類(lèi)計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞，檢查兩張涂片，取其平均數(shù)，得出各種細(xì)胞所占百分率。
1?2?4 痰上清液IL?8、TNF?α濃度的檢測(cè)
IL?8、TNF?α采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。操作步驟按試劑盒(美國(guó)GeneMay公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，敏感度為16 pg/ml。
1?3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較分析用t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。數(shù)值變量之間的依存關(guān)系用相關(guān)系數(shù)r表示，并應(yīng)用t檢驗(yàn)，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件醫(yī)用CS10?3、Microsoft excell處理原始數(shù)據(jù)，并圖示其相關(guān)性。
2 結(jié) 果
2?1 COPD組與HS組病例資料比較
見(jiàn)表1。表1 COPD組與HS組病人資料比較(略)
2?2 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)
痰液中的細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。COPD組誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞百分比明顯高于HS組（t=8?34）及HNS組（t=11?15 ），差異有顯著性（P＜0?01）。HS組與HNS組痰中性粒細(xì)胞的百分比相比較，差異有顯著性(t=3?48,P＜0?01)。各組間嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分類(lèi)差異無(wú)顯著性（見(jiàn)表2）。表2 各組痰液細(xì)胞分類(lèi)的比較(略
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